實(shí)驗(yàn)原理
1.普通光學(xué)顯微鏡是一種精密的光學(xué)儀器。當(dāng)前使用的顯微鏡都是由一套透鏡組成的。普通光學(xué)顯微鏡通常能將物體放大 1500-2000倍。分辨率（可辨出兩點(diǎn)間*小距離），公式如下： D = 0.5λ / n*sinα/2
公式中：λ為所用光源波長；α為物鏡鏡口角；n為玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率。
*短可見光450nm?？諝鈔=1.0；水n=1.33；香柏油 n=1.52。
光學(xué)顯微鏡在*短波長450nm，用油鏡其*大的分辨率為0.18μm。肉眼正常德分辨率為0.25mm。因此光學(xué)顯微鏡有效的*高總放大倍數(shù)能達(dá)到1000~1500倍。
根據(jù)上式，可通過：（1）減低波長；（2）增大折射率；（3）加大鏡口角來提高分辨力。紫外線作光源的顯微鏡和電子顯微鏡就是利用短光波來提高分辨力以檢視較小的物體的。

數(shù)值孔徑（numerical apeature簡(jiǎn)寫為NA）是物鏡的主要參數(shù)，是決定物鏡性能的*重要指標(biāo)。
數(shù)值孔徑可用下式表示：NA= n* sinα/2
鏡口角α總是小于180°。因?yàn)榭諝獾恼凵渎蕿?，所以干燥物鏡的數(shù)值孔徑總是小于1，一般為0.05~0.95；油浸物鏡如用香柏油（折射率為1.515）浸沒，則數(shù)值孔徑*大可接近1.5。雖然理論上數(shù)值孔徑的極限等于所用浸沒介質(zhì)的折射率，但實(shí)際上從透鏡的制造技術(shù)看，是不可能達(dá)到這一極限的。通常在實(shí)用范圍內(nèi)，**油浸物鏡的*大數(shù)值孔徑是1.4。
2. 細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須對(duì)它們進(jìn)行染色，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
常用堿性染料進(jìn)行簡(jiǎn)單染色，因?yàn)樵谥行?、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞常帶負(fù)電荷，而堿性染料電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對(duì)比，在顯微鏡下更易于識(shí)別。常用的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。

染色前必須固定細(xì)菌。熱固定的目的有三：一是殺死細(xì)菌以固定其形態(tài)；二是使菌體粘附于玻片上；三是改變細(xì)胞壁的通透性，增加其對(duì)染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。

實(shí)驗(yàn)材料
1.菌種：黃色四聯(lián)球菌（12~18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物）
2.染色劑：石炭酸復(fù)紅染液。
3.儀器或其他用具：顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，玻片擱架、雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯），擦鏡紙，生理鹽水或蒸餾水等。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟：
內(nèi)容一：顯微鏡的使用操作及注意事項(xiàng)：顯微鏡結(jié)構(gòu)精密，使用時(shí)必須細(xì)心，要按下述操作步驟進(jìn)行。
（一）觀察前的準(zhǔn)備
1. 拿取顯微鏡時(shí)，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地將顯微鏡搬運(yùn)到實(shí)驗(yàn)桌上。
2.將顯微鏡放在自己身體的左前方，離桌子邊緣約10cm左右，右側(cè)可繪圖；如果使用的是為雙目生物顯微鏡，可放在正前方。
3.調(diào)節(jié)光照：自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照強(qiáng)弱。
4.調(diào)節(jié)光軸中心：顯微鏡在觀察時(shí)，其光學(xué)系統(tǒng)中的光源、聚光器、物鏡和目鏡的光軸及光圈的中心必須跟顯微鏡的光軸同在一直線上。
（二）低倍鏡觀察 鏡檢任何標(biāo)本都要養(yǎng)成必須先用低倍鏡觀察的習(xí)慣。因?yàn)榈捅剁R視野較大，易于發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。
將標(biāo)本片放置在載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使被觀察的標(biāo)本處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使物鏡調(diào)至接近標(biāo)本處，用目鏡觀察并同時(shí)用粗調(diào)節(jié)旋鈕慢慢升起鏡筒（或下降載物臺(tái)），直至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕使物像清晰為止。用推動(dòng)器移動(dòng)標(biāo)本片，找到合適的目的像并將它移到視野中央進(jìn)行觀察（自己想想：推動(dòng)器上的兩個(gè)標(biāo)尺是做什么用的？）。
（三）高倍鏡觀察 在低倍物鏡觀察的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)換高倍物鏡。較好的顯微鏡，低倍、高倍鏡頭是同焦的，在正常情況下，高倍物鏡的轉(zhuǎn)換不應(yīng)碰到載玻片或其上的蓋玻片。在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)要從側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后從目鏡觀察，調(diào)節(jié)光照，使亮度適中，緩慢調(diào)節(jié)粗調(diào)節(jié)旋鈕，使載物臺(tái)上升（或鏡筒下降），直 至物像出現(xiàn)，再用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至物像清晰為止，將觀察部位移至視野中央進(jìn)行觀察。
（四）油鏡觀察 油浸物鏡的工作距離很短，一般在0.2mm以內(nèi)，并且無"彈簧裝置"，因此使用油浸物鏡時(shí)要特別細(xì)心，避免由于"調(diào)焦"不慎而壓碎標(biāo)本片并使物鏡受損。使用油鏡按下列步驟操作：
1.先用粗調(diào)節(jié)旋鈕將鏡筒提升（或?qū)⑤d物臺(tái)下降）約2cm，并將高倍鏡轉(zhuǎn)出。
2.在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。
3.從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)緩緩地上升，（或鏡筒下降），使油浸物鏡浸入香柏油中，使鏡頭幾乎與標(biāo)本接觸。
4.從接目鏡內(nèi)觀察，放大虹彩光圈，上調(diào)聚光器，使光線充分照明。用粗調(diào)節(jié)旋鈕將載物臺(tái)徐徐下降（或鏡筒上升），當(dāng)出現(xiàn)物像一閃后改用細(xì)調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)至*清晰為止。如油鏡已離開油面而仍未見到物象，必須再從側(cè)面觀察，重復(fù)上述操作。
5.觀察完畢，下降載物臺(tái)，將油鏡頭轉(zhuǎn)出，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，再用擦擦鏡紙蘸少許二甲苯或乙醚酒精混合液（乙醚2份，純酒精3份），擦去鏡頭上殘留油跡，*后再用擦鏡紙擦拭2~3下即可，（注意向一個(gè)方向擦拭）。
6. 將各部分還原：下降載物臺(tái)*低處；轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡鏡頭轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋轉(zhuǎn)至*低處；將調(diào)節(jié)光源亮度的旋鈕*小化；關(guān)掉電源；用柔軟紗布清潔載物臺(tái)等機(jī)械部分，放好顯微鏡，蓋上罩。（如果是自然采光顯微鏡，降下聚光器，反光鏡與聚光器垂直）。
內(nèi)容二：細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色
1. 涂片：取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴蒸溜水于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。注意蒸餾水和取菌時(shí)不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。
2.干燥：室溫自然干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。但切勿離火焰太近，因溫度太高會(huì)破壞菌體形態(tài)。
3. 熱固定：將玻片連續(xù)從酒精燈火焰上通過3～4次。
4. 染色：將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液1～2滴于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。石炭酸復(fù)紅20~30秒
5.水洗：傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片**下的水無色為止。水洗時(shí)，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。
6.干燥：甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風(fēng)吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。
7. 鏡檢：涂片干后鏡檢。低倍-高倍-油鏡。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。