隨著檢測設(shè)備的提升、各種顯微技術(shù)的發(fā)展和標(biāo)記手段的提高，如激光共聚焦顯微鏡在生物學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，使得研究者能夠迅速、準(zhǔn)確地觀察到蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況和定位。
通過顯微鏡觀察熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和分子，為生物學(xué)的研究提供了更直觀的觀測手段。因此免疫熒光樣品的制備也成為生物學(xué)研究中的基本技術(shù)方法。
鑒于生物體內(nèi)的復(fù)雜多樣性，制備免疫熒光樣品的方法也存在一些差異。本文主要介紹構(gòu)建綠色熒光融合蛋白表達(dá)載體，并在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光融合蛋白及免疫熒光樣品的制備過程。
將構(gòu)建好的熒光表達(dá)載體進(jìn)行大量擴(kuò)增，并通過質(zhì)粒抽提試劑盒大量純化，得到不含有內(nèi)毒素的純化質(zhì)粒。將表達(dá)載體導(dǎo)入到培養(yǎng)細(xì)胞中后，經(jīng)過培養(yǎng)即可進(jìn)行熒光蛋白的檢測。而將基因?qū)氩溉閯?dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞的方法有很多種，生化轉(zhuǎn)染法是很常用的導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞方法。
為了方便在激光共聚焦顯微鏡上觀察，免疫熒光樣品通常需要制備在載玻片上。培養(yǎng)的細(xì)胞需要在蓋玻片上貼壁生長。蓋玻片的厚度應(yīng)小于0.17mm。購買到的蓋玻片需要用玻璃洗液浸泡處理一天以上，再用去離子水沖洗掉殘存的洗液。
蓋玻片經(jīng)過高溫滅菌處理后，放置在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用于培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于貼壁不牢的細(xì)胞，或者與細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的研究，玻璃片需預(yù)先包被細(xì)胞外基質(zhì)，如poly-L-Lysine，F(xiàn)ibronectin，Laminin等。
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